PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO


El crecimiento de microorganismos, su multiplicación implica que necesitan duplicar su material celular, estas utilizan elementos químicos que provienen del medio ambiente para tensformarlos en constituyentes característicos que la componen.
Cuando los microorganismos se separan de donde adquieren nutrientes y se cultivan en laboratorios o industrias, se deben usar medios que contengan elementos químicos necesarios para su crecimiento.
Un medio de cultivo es una solución acuosa que contiene nutrientes apropiados para el crecimiento óptimo de un microorganismo.
Nutrientes que requiere una célula para su crecimiento (duplicación) vendrán determinados por la composición de las células. Se clasifican en 4 grupos:

1. Macronutrientes: son requeridos en grandes cantidades tales como el carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno.
2. Micronutrientes: son requeridos en pequeñas cantidades tales como fósforo, potasio, azufra, magnesio.
3. Vitaminas y minerales.
4. Elementos taza: hierro, zinc, cobre, manganeso, molibdeno, cobalto.

Los medios utilizados en el cultivo de microorganismos contiene todos los elementos en forma adecuada para síntesis de material celular y producción de productos metabólicos.


Los medios químicamente definidos se preparan adicionando cantidades precisas de sustancias orgánicas o inorgánica puras al agua destilada, se conoce la composición química exacta de un medio definido.
Los medios complejos emplean extractos de sustancias altamente nutritivas aunque químicamente indefinidas, una desventaja importante del uso de medios complejos es la pérdida de control sobre las especificaciones precisas de nutrientes del medio. La composición de los medios debe ser constantemente adaptada al proceso de fermentación.
Los medios de cultivo se pueden preparar para ser usados en estado líquido, o en estado gel (semi-sólido). Un medio de cultivo líquido es convertido en el estado semi-sólido si se le añade un agente gelificante. El agar es el agente gelificante de mayor uso. Se fabrica a partir de algas marinas y no es nutriente para la mayoria de microorganismos.
Los micronutrientes (oligoelementos) casos especiales en preparación de medios. La mayor parte de los minerales se requieren en cantidades sumamente pequeñas, en medios químicamente definidos se adicionan en pequeñas cantidades a partir de una solución madre que contiene mezcla de metales y minerales.


MATERIAS PRIMAS EMPLEADAS EN FERMENTACIONES INDUSTRIALES.

1. Fuente de carbono.

Los carbohidratos son tradicionalmente las fuentes de carbono utilizados en ola industria de la fermentación. La glucosa o la sacarosa puras rara vez son utilizadas como única fuente de carbono, excepto en procesos que exigen un control exacto de la fermentación.

• Las melazas, subproducto de producción de azúcar, fuentes más baratasde carbohidratos. Contienen sustancias nitrogenadas, vitaminas y elementos taza. Su composición varía dependiendo de la materia prima utilizada para la producción  de azúcar (caña o remolacha) y su calidad depende del origen, condiciones climáticas y proceso de producción.
• Extracto de malta, un extracto acuoso de la cebada malteada (cabada germinada que produce enzimas que hidrolizan el almidón) es un sustrato excelente para muchos hongos filamentosos, levaduras y actinomicetos. El extracto seco contiene aproximadamente 90-92 % de carbohidratos y está compuesto de hexosas (polímeros de glucosa). Los medios de cultivo que contienen extracto de malta deben ser esterilizados cuidadosamente. Cuando existe sobrecalentamiento se produce la reacción de Miallard debido al bajo pH y la alta proporción de azúcares reductores.
• La celulosa, está siendo exactamente estudiada como sustrato de fermentación. Producción anual de celulosa es grandisima. Mayor parte de ella existe como residuos en formas tales como paja, residuos de las mazorcas, desechos de la madera y residuos de papel. Frecuentemente no es posible utilizar la celulosa directamente como fuente de carbono, debe ser hidrolizada primero químicamente o enzimáticamente.
• Los aceites vegetales, como el aceite de soya, el aceite de algodón y el aceite de palma son utilizados como cosustratos, siendo añadidos al medio en el que los carbohidratos proporcionan la principal fuente de energía.

        2.Fuente de nitrogéno

• El líquido de maceración del maíz, fuente de nitrógeno que es metabolizada eficientemente; se forma durante la producción de almidón a partir de maíz. Este líquido contiene numerosos aminoácidos como alanina, arginina, ácido glutámico, isoleucina, treonina, valina, fenilanina, metionina y cisteína.
• Los extractos de levadura, son excelentes para muchos microorganismos. Son producidos a partir de levaduras de panadería mediante análisis a 50-55°C. La composición del extracto varía de un lote a otro, parcialmente debido a que los ustratos utilizados para el cultivo de levaduras afectan a la calidad del extracto de levaduras obtenido.
• Las peptonas (hidrolizados de proteínas) pueden ser utilizadas por muchos microorganismos pero son relativamente caras. Las fuentes de peptona incluyen la carne, caseína, gelatina, queratina, semilla de cacahuate, harina de soya, semillas de algodón y semillas de girasol. La composición varía dependiendo de su origen.

 Esterilización industrial.


La esterilización es el proceso de conseguir la esterilidad, en la que no exiten grados: un objetivo, superficie o sustancia es no esteril. Si es estéril no contiene organismos viables o células presentes y si le protege contra la contaminación, la condición estéril permanecera indefinidamente. La esterilización se define como cualquier método, el cual es capaz de destruir o remover contaminantes microbianos no deseados.


Los procedimientos de stérilización son aplicados para:

1. asegurar que un proceso sea llevado a cabo solamente con el organismo deseado.
2. permitir la utilización segura de los microorganismos
3. evitar contaminación ambiental
4. impedir el deterior de un producto.

Para poder llevar a cabo una fermentación con éxito es imprescindible y obligatorio tener en todas las etapas cultivos libres de contaminación, desde el cultivo preliminar hasta el fermentador de producción. También se deben esterilizar los aditivos (antiespumantes), sin embargo los ácidos y bases concentrados no es necesario esterilizados. 
Un biorreactor puede ser esterilizados, destruyendo los microorganismos, con algun agente letal como el calor, radiación o un producto químico o bien, separando los organismos viables mediante un procedimiento físico como la filtración.
Durante la fermentación se deben observar dos puntos para asegurar la esterilidad:

• esterilidad en el medio de cultivo.
• esterilidad del aire que entra y sale.

Esterilización del medio de cultivo.


El medio nutritivo que se prepara inicialmente contiene una variedad de células vegetativas diferentes y de esporas que proceden de los constituyentes del medio, del agua y del recipiente. Estos microorganismos deben ser eliminados por un procedimiento adecuado antes de la inoculación.
Existen dos tipos de esterilización de medios:

1. Eliminación física, donde puede utilizar:

• filtración.
• centrifugación.
• flotación.
• atracción electrostática.

      2. Eliminación por destrucción, donde se puede utilizar:

• calor húmedo.
• calor seco.
• radiación sónica.
• agentes químicos.

Un conjunto de factores influyen en el éxito de la esterilización por calor: el número y tipo de microorganismos presentes, la composición del medio de cultivo, el valor del pH y el tamaño de las partículas de suspensión.
La esterilización por filtración se utiliza frecuentemente para todos los componentes  de la solución de nutrientes que son sensibles al calor y que serían por tanto desnaturalizados durante el proceso de esterilización por vapor utilizado normalmente en fermentación industrial.
Existen 2 métodos para la esterilización por calor: la esterilización discontinua y la esterilización continua.

1. Esterilización discontinua.

La mayor parte de los medios de cultivo se esterilizan en volúmenes discontinuos en biorreactores a 121° C. Los tipos de esterilización aproximados pueden ser calculados a partir de la naturaleza del medio y del tamaño del fermentador. Un método de esterilización es inyectar vapor en la camisa del fermentador o en los serpentines interiores. Otro método es inyectar vapor en la propia solución de nutrientes. Con la inyección directa de vapor el condensado se acumula dentro del fermentador y de esta forma de volumenes del líquido aumenta durante el proceso de esterilización.

     2. Esterilización continua.


El calentamiento del medio de cultivo para la esterilización continua puede ser llevado a cabo mediante inyección de vapor o mediante intercambiadores de calor. La esterilización  con inyección de vapor se hace inyectando vapor en la solución de nutrientes. La temperatura se eleva rápidamente a 140° C y se mantiene durante 30-120 segundos.
En el proceso continuo que utiliza intercambiadores de calor, la solución de nutrientes, en el primer intercambio de calor, se precalienta a 90-120 °C durante 20-30 segundos por la solución nutritiva previamente esterilizada que sale.